水蛭素结构及活性

五、水蛭素结构及活性

1、水蛭素的结构： 20世纪60年代发展了天然水蛭素的分离和纯化技术，得出水蛭素是由65个氨基酸组成的低分子多肽，其分子量仅为7000D。20世纪70年代确证了肽链的组成和一级结构。20世纪80年代完成了二级和三级结构分析。N端有3个二流桥，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽链结构。C端富含酸性氨基酸残基，局亲水性，游离在分子表面。肽链中部还有一个由pro-lys47-pro组成的特殊序列，不被一般蛋白酶所降解。水蛭素的活性作用机制：水蛭素是现在知道的最强的凝血酶特异性抑制剂，带负电荷的C端结构再凝血酶的带正电荷的纤维蛋白原识别位点，最小保持抗凝活性的片段为酸性C端的10-12个肽段，C端12具有最大活性的最小肽段。N端密集链段则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。Tyr-63的硫酸化可提高凝活性，The56，Glu57，lle59是抗凝中必不可少的，水蛭素4位赖氨酸残基同靠近凝血酶催化位点附近的精氨酸侧链（ArgSide Chain Pocket）代夫电话的碱基，起着促进N端与活性位点结合等重要作用，lys47也通过氢键和静电两种作用力同时影响水蛭素的三维结构。2个分子结合比例为1：1，解离常数为K=2.3×10-14mol/L，故复合物非常稳定，使凝血酶不能分解纤维蛋白原，及不能诱导血小板反应，也使凝血酶的刺激成纤维细胞增生和平滑肌细胞收缩缝作用受抑制，从而达到抗凝的效果。

参考文献：陈华友、黄静、蒋芝君、刑自立、吴自荣. 抗凝良药水蛭素的研究进展[J].生命学通报，2003，38（3）：3-5。

2、1955 年,前东德科学家Markwardt 分离出高纯度水蛭素,经鉴定它是一种含有65 - 66 个氨基酸的单链多肽,分子量为7000 ,对凝血酶有高度的亲和力,并以1∶1的方式与之形成紧密的非共价键相结合的可逆性复合物,使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力,阻止纤维蛋白的凝固,减少凝血酶催化的凝血反应(如因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅻ的活化) 及凝血酶诱导的血小板反应。静脉注射水蛭素0. 1 mg/ kg 或皮下注射相同剂量的水蛭素,60 min 后血液中的水蛭素浓度即

开始增加,5 h 后逐渐下降,水蛭素大多以活性形式通过肾脏排出。    参考文献：殷国前，孙智勇，杨晓楠，杨健祥，王　刚，滕晓颦. 水蛭及水蛭素再度风行的生物疗法. 中国美容整形外科杂志[J].2007.8,18(8)：305-307.

4、结构：是一条含65或66个氨基酸残基的单链多肽，贩子质量为7ku，其N末端有3对二硫键（Cys6- Cys14, Cys16- Cys28, Cys32- Cys39）,使肽链绕叠成密集形核心环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。其N末端含活性中心，能识别底物-凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。C末端富含酸性氨基酸残基，最后9个氨基酸中有6个为酸性氨基酸。天然水蛭素第63位的络氨酸残基被硫酸化，而重组水蛭素没有这个特殊的结构，因此后者抗凝比活性有所下降。水蛭素肽链中部还有一个由pro-lys47-pro组成的特殊序列，不被一般蛋白酶所降解。有两个作用：①维持水蛭素分子的稳定性；②引导水蛭素分子以正确的方向与凝血酶分子结合。

参考文献：[1]、张士斌. 水蛭素的基础研究现状及临床应用展望.北京医学[J],2008,28(3)：173-175.

[2]、杨丽娅,高菂水蛭素与凝血酶作用的探讨. 西北药学杂志　2007.4，22（2）：95-96. 

5、重组水蛭素的结构：重组水蛭素recombinant hirudin）与天然水蛭素的结构极其相似，也是由65个氨基酸残基组成的多肽，但在63位酪氨酸残基上无硫酸。它的一级结构具有C端谷氨酸和门冬氨酸含量丰富的特点，肽链中有多个半胱氨酸残基，序列中第27、36、47位是赖氨酸。空间结构与天然的相同：其核心区由氨基酸3-30、37-46、56-67三个肽段组成，指状区由31-37肽段组成，C端尾区由50-65肽段组成。    

参考文献：[1]王鸿利，于立志.水蛭素的基础与临床.血栓与止血学杂志[J]，1998,5（2）:86-88、61    

[2]张国龙.水蛭素的研究及临床应用进展. 江苏药学与临床研究[J].2003,11(6):15-17

6、水蛭素是含65个氨基酸的多肽， 分子量为7000左右， 含三个二硫键。已分离鉴定出7种异构体 ，水蛭素的=级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用。二硫键是决定其分子构型的稳定性， 保持高抗凝活性的关键 。当二硫桥键被氧化或还原， 或者分子发生了蛋白降解， 则失去抗凝活性。若水蛭素的羧基被酯化， 或失去酸性的C一端氨基酸， 也会失去与凝血酶结合的能力 。研究表明． 水蛭素与凝血酶活性位置结合的结构单元仅存在于C 端残基中， 水蛭素的 一端虽无与凝血酶结合的位置，但结合到凝血酶上的水蛭素的N一端残基亦有抑制凝血酶催化活性的作用水蛭素N一端构型对其同凝血酶作用的影响，发现N一端残基的疏水性结构对水蛭素抗凝血酶作用有重要影响。水蛭素在干燥状态下是稳定的， 室温下在水中稳定存在6个月．8O℃ 下加热15min不被破坏。提高溶液的pH值，其稳定性则降低。20℃下，在0.1mol/L HCL或0.1mol/L NaOH中，可稳定15min。胰蛋白酶钠和α-糜蛋白酶不破坏水蛭素的活性， 而番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A可使水蛭素失去活性。   

参考文献：欧暑长 丁家欣 张 玲. 水蛭素的研究概况.中国药学杂志[J].1991,26(7)：396-399.

7、水蛭素的组成结构：水蛭索~hirudin．HV)共有7个异构体，是一种单链环肽化合物。肽链由65个氨基酸残基组成，相对分子量为7000道尔顿。分子N 端有三个二硫桥键(一S—S一)。使N 端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C端富含酸性氨基酸残基．63位的酪氨酸被硫酸化(Tyr—SO。H)“ 。水蛭素存在十种以上变异体．主要的三种简称为HV1、HV2和HV3。其氨基酸序列如下所示。

HV1：VVYDTCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

HV2：ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPNPESHNNGDFEE1PEEYLQ

HV3：ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPKPQSHNQGDFEEPIPEDAYDE

这些变异体主要差别是N 端氨基酸序列不同，但都具有相似的抗凝活性。  

参考文献：高雪涛，段志强，高 晶. 水蛭素的应用及研究进展. 黑龙江医药[J].2003,16(1)：38.

8、水蛭素的稳定性：加热0���5 h后, 大部分水蛭素活性丧失。水蛭素粗提物制备过程中(包括冷冻真空干燥处理) 始终保持低温状态, 所得水蛭素粗提物在干燥状态下非常稳定。中医药学药理及临床试验证明: 水蛭系列产品生服效果显著高于熟服。体外抗凝血试验亦表明, 冰水状态下保存3 a其活性仅降低约15%, 室温下在水中可稳定存在180 d, 80度以下加热15min不被破坏。胰蛋白酶钠、糜蛋白酶不破坏水蛭素活性; 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A 可使水蛭素失去部分活性。  

参考文献：杨恩昌，水蛭素可利用性分析，河北农业科学，2010,14（7）：52-53.